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基迪奥七周年,ATAC-seq免费送

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    发表于 2019.3.29 09:30:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
    在本周二的微信文章中,我们提到定位染色质中的可变开放区,是寻找转录前调控核心因子的关键线索,并详细解析了转录前调控的各个关键要素(戳这里)。这篇文章发出后阅读量极高,可见大家普遍对这个领域关注度极高。我们在文末提到有个彩蛋,将在周四公布,那么现在惊喜来了~




    在基因组开放性研究中,目前最强大最主流的技术是ATAC-seq。ATAC-seq(染色质易开放区域测序)是利用Tn5转座子酶对基因组的染色质进行切割并引入测序接头,然后构建文库,对基因组上的开放染色质进行测序的一种技术。
    ATAC-seq将表观研究的本质聚焦到染色质的易接近性变化,是联系复杂表观/转录调控与转录组变化的关键点,可将表观遗传研究化繁为简。目前,ATAC-seq是表观研究的最新手段和高分文章的利器,文章数量以每年翻一倍的速度快速增长。在下文,我们会继续介绍ATAC-seq技术的原理。 作为一家做促销很“克制”的公司,为助力大家发表高分文章,基迪奥现推出ATAC-seq促销优惠活动,只要填写相关项目信息,就有机会赢取ATAC免费建库测序。
    活动内容

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    图1 几种常见的基因组可接近性检测的方法出现时间和效果示意图   

    MNase-seq——间接检测开放区

    微球菌核酸酶(microccocal nuclease,MNase)是一种同时具有内切和外切酶活性的核酸酶。因为兼顾具有内外切酶的活性,MNase会逐渐一点一点咬下任何“裸露”的DNA,除非DNA被核小体或其他蛋白结合而得到保护。
    即MNase只降解核小体连接区和开放区的DNA,而被蛋白保护的DNA不被降解。利用这一特性,只要将甲醛固定后的染色质用MNase进行酶切处理,然后富集剩余的DNA片段, 这些DNA区域就是核小体包裹或者被转录因子绑定的区域(图1b)。
    从图1b可以看出,MNase-seq主要用于研究核小体位置的技术,开放区的信号本身是缺失的(因为开放区的DNA已经被完全降解而无法检测)。所以,MNase-seq只能间接检测染色质开放区,并非基因组开放区检测的最优技术。

    DNase-seq技术——较早出现的直接检测开放区

    DNA酶I(DNase I)是我们熟悉的一种核酸内切酶。同样的,DNase I无法酶切被核小体或其他蛋白保护的DNA片段,而且DNase I优先切割染色质中的开放区。所以染色质开放区通常也是DNase I超敏感位点(DNase I hypersensitive site,DHS)。
    因为是核酸内切酶,只要酶切条件控制得当,DNase I不至将开放区的DNA完全切成单碱基状态,而是只是将开放区的DNA酶切为片段,为后续的测序提供了可能。
    简单说来,DNase-seq就是利用DNase I优先切割染色质中开放区的特性,富集被切割下来的DNA片段进行测序,从而实现对基因组的开放区的检测(图1b)。该技术出现比较早,所以在人类ENCODE计划中大量使用。
    但该技术对细胞起始量的要求较高,一般细胞数量要达到1~10 Millions,实验复杂(包括精确的细胞定量,酶浓度的控制等),并且实验准备时间较长,需要2-3天。

    FAIRE-seq——相对简单但噪音高的直接检测技术

    FAIRE-seq与DNase效果相似,但实验更简单。其大概实验过程是,在甲醛固定核小体-DNA的结合关系后,用超声波破碎染色质,并用有机溶剂酚-氯仿抽提。酚氯仿抽提DNA后会使溶液分层,上层为水相,含有DNA(主要为裸露的DNA);中间为蛋白(包含核小体-DNA复合物)。只要富集水相的DNA并进行测序,即可以获得开放区的信息。
    该技术最大的不足:1)DNA片段大小不易控制,因此开放区检测精度较差;2)数据往往有较高的背景(非开放区DNA)噪音,导致数据可靠性下降。

    ATAC-seq——最新最高效的直接检测开放区技术

    ATAC-seq是最晚出现的技术,也是发展最为迅速的技术。ATAC-seq的全称是Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing。首先简要介绍一下转座子(Transposon)。
    转座子在生物基因组中普遍存在,是可以不断自我移动并插入基因组新的位置的“跳跃元件”。转座子的移动,离不开其自身编码的转座酶的作用。转座酶基本作用机制:可以随机结合并切割开放裸露的DNA,并在切割位点插入其自身携带的DNA序列。
    利用转座酶的这一特性,基因工程人员可以让转座酶携带上二代测序接头。这样转座酶在切割基因组DNA时(相当于随机打断DNA),不但切断了DNA还自动加入了一段二代测序接头,从而减少了文库构建的一个步骤,降低了文库构建所需的样本起始量(图2a)。
    同时,和其他核酸酶类似,在切割染色质DNA的时候,转座酶主要切割基因组开放的区域。而核小体致密排列的闭合染色质区,转座酶是无法切割的(图2b)。
    转座酶酶切后,对酶切片段DNA进行富集,就实现了对基因组开放区DNA的获取。有一点不同的是,转座酶也可以切割染色质开放区附近的核小体间连接区的DNA,从而也可以得到核小体的印记信息。在这一点上说,ATAC-seq的结果与DNase-seq非常相似,同时具有部分MNase-seq的特性(图1b)。


    图2 转座酶用于ATAC-seq的原理

    那么ATAC-seq技术最大的优点是什么呢?有两点:
    1建库起始量低
    因为ATAC-seq一步实现片段化基因组DNA和加入测序接头,大大降低了样本起始量要求。相比FAIRE-seq和DNase-seq的一百万细胞起始量要求,ATAC-seq仅仅需要500个甚至更低的细胞量即可满足建库,对于稀有样本的检测是很好的优势。
    2样本制备简单
    相比其他技术需要进行复杂的样本准备(例如甲醛固定)和精确的酶浓度定量,ATAC-seq建库步骤更简单快捷,从而减少了长时间操作导致的样本不稳定。
    当然,那怕是ATAC-seq也要经历复杂的细胞核提取过程,实验难度依然较大。因此ATAC-seq的数据依然比较宝贵,其依然是发高分文章的利器。

    图3 三种基因组可接近性检测技术的建库要求比较

    以上就是几种基因组可接近性技术的介绍和比较。应该说,理想条件下这几种技术可以得出相似的结果。所以在一些大文章中,为了证明自己的数据可靠,作者也会同时陈列几种技术检测的结果。
    如下图,文章作者就是想呈现ATAC-seq和DNase-seq、FAIRE-seq的峰基本是一致的。同时,也可以看到,在500个细胞的条件下,ATAC-seq依然有非常优异的表现。


    图4 几种基因组可接近性检测结果的比较(DOI:10.1038/NMETH.2688)

    图5 谷歌学术检索“ATAC-seq”的文章数量

    正因为ATAC-seq的这些优点,从2013年面世以来,ATAC-seq相关的文章以几乎每年增长一倍的数量快速增加。那么,ATAC-seq到底可以做哪些分析,如何吸引大家关注呢?请看我们后续的文章介绍ATAC-seq的文章应用思路。
    技术介绍完了,大家是否对ATAC-seq有了更深的期待了呢?那么,可以回到文章开头,扫二维码参与ATAC-seq免费活动吧。




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    发表于 2019.3.30 13:04:42 | 显示全部楼层
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  • TA的每日心情

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     楼主| 发表于 2019.4.4 09:46:47 | 显示全部楼层

    优秀
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  • TA的每日心情
    好棒
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    发表于 7 天前 | 显示全部楼层
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