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 分离型CRISPR- Cpf1平台-用于诱导型基因组编辑和基因激活

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    发表于 4 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式
    本文转自微信公众号:植物生物技术Pbj

    新兴出现的CRISPR-Cpf1,即Cas12a,也是RNA指导的DNA核酸酶,其进一步扩大了CRISPR技术的应用范围和多功能性。首先,Cas9识别富含G的PAM,但Cpf1识别富含T的PAM,因此可以靶向Cas9不能靶向的基因组区域。其次,Cpf1由较短的CRISPR RNA(crRNA)引导,可以将单个转录物crRNA阵列加工成多个crRNA,这有利于靶向多重基因。最新研究表明,与Cas9相比,Cpf1在稳定结合靶DNA方面有更高的序列特异性。目前,Cas9已经工程化为各种复杂的技术,如诱导型的基因组编辑和高效的内源性基因激活,但Cpf1仍未得到广泛的应用。

    近日,Nature Chemical Biology在线发表了日本 Yoshibumi Ueda和Moritoshi Sato实验室合作的题为"A split CRISPR–Cpf1 platform for inducible genome editing and gene activation"的研究论文。




    在该研究中,研究人员为了提高Cpf1的实用性和多功能性,设计了一个分离的Cpf1平台,即将Cpf1分为N末端和C末端两个片段。首先,研究人员将裂解产生的34个Lachnospiraceae细菌 Cpf1(LbCpf1)的成对分裂片段,分别与雷帕霉素诱导二聚化系统FKBP-FRB融合,用以确定LbCpf1的最佳分裂位点并且测定雷帕霉素诱导的这些分裂Cpf1在人HEK293T细胞的基因组编辑活性。结果显示,雷帕霉素诱导的分裂型LbCpf1在哺乳动物细胞中展示出了有效的基因组编辑。




    因为雷帕霉素诱导的反应不可逆并具有副作用,因此研究人员在此基础上创建了可光活化Cpf1(paCpf1)——将分离型Cpf1片段与光诱导二聚化结构域融合的N730和C731片段组成的磁体系统结合。结果证实,paCpf1可广泛用于在哺乳动物细胞中进行光控基因组编辑,而且相对于全长Cpf1而言,其产生的脱靶效率并未提高。因此,paCpf1系统可以实现对活细胞基因组在空间、时间上的可逆可控编辑。




    另一方面,研究人员发现全长dCpf1只能在其N末端和C末端结合转录激活结构域,但在自身二聚化的分裂型dCpf1中,转录激活结构域不仅可以融合到原始的N和C末端,而且可以融合到新产生的两个末端。因此,dCpf1可以募集更多的转录激活结构域,从而实现稳健的靶向基因激活。在本研究中,研究人员设计了被称为dCpf1-SA2.0的转录激活系统,该系统由各末端均融合p65-HSF1激活结构域的自发二聚化分裂dCpf1片段组成。结果发现,dCpf1-SA2.0具有比现有dCas9激活剂以及先前报道的dCpf1激活剂更为有效地激活内源基因的潜力。



    原文链接:https://www.nature.com/articles/s41589-019-0338-y



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