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[技术前沿] 新冠病毒最新组学研究结果文献汇总

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    发表于 2020.3.23 09:56:28 | 显示全部楼层 |阅读模式
    摘要

    自2019年12月以来,新冠肺炎疫情变化牵动着亿万国人的心,截止目前为止,全国累计确诊人数已经超过8万,通过加强人员流动管理、提高个人防护意识等一系列举措,国内现存确诊人数正缓慢下降。但是从2月底开始,全球多个国家的确诊人数开始急剧上升,截止目前为止,国外累计确诊人数已经已经超过16万。因此在未来很长一段时间,这场疫情仍是会我们关注的焦点。

    此次疫情的罪魁祸首是一种名为SARS-CoV-2[1](名称仍有争议,之前被广泛接受的是2019-nCoV)的新型冠状病毒,它与SARS-CoV、MERS-CoV都是β冠状病毒家族成员[2]。早在2020年1月10日,SARS-CoV-2基因组序列就已经公开[3],相关的组学研究也逐渐开展起来。

    基于病毒的基因组序列,我们可以从基因组学研究的角度,解析其基因组结构、预测各结构的功能、预测蛋白的3D结构和功能。在基因组学研究的基础上,我们可以利用转录组学对病毒的致病机制进行预测,为病毒的分子实验研究提供理论参考。

    现有的SARS-CoV-2组学研究相关文献的大致思路也是这样,首先利用二代测序技术获取基因组序列,进行病毒鉴定;对基因组序列进行序列比对和进化树分析,探究病毒来源和潜在宿主;基于基因组结构解析,预测Spike蛋白的三级结构,提供潜在的受体结合位点;分子实验验证病毒受体为ACE2后,利用转录组数据,分析受体在人体不同组织、器官或细胞的分布,为病毒的预防和致病机理的探究提供理论指导。

    1. 病毒鉴定

    为获知新冠病毒SARS-CoV-2的基因组序列,从而开展更有针对性的研究,组学测序是主流方法。

    目前获取基因组主要有两种方法,一种是常规方法,先利用合适的细胞系进行病毒分离,得到浓度较高的病毒后进行RNA提取,去除人类RNA后反转录成cDNA,再构建文库并测序,序列拼接后进行Blast比对,寻找同源性最高的序列,确定病原[4];另一种则是基于宏基因组测序技术,不需要分离培养病毒,直接从患者的组织中提取总RNA,经反转录成cDNA构建文库,进行宏基因组测序,去除人类基因组序列后,将所得到的拼接序列进行Blast比对,寻找同源性最高的序列[2, 3, 5, 6]。由于新型病毒现阶段还是存在分离和培养的难题,现在宏基因组测序技术为越来越多的研究者青睐。

    近期研究结果发现,新冠病毒SARS-CoV-2的基因组全长约30000nt,与其它冠状病毒相似。目前世界各地的研究团队所获取的基因组序列相似度达99%以上,详细参见GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/)和GISAID数据库(https://www.gisaid.org/

    图1 基于mNGS技术获取病原微生物核酸序列流程[7]

    2. 病毒溯源和宿主寻找

    基于不同冠状病毒的基因组序列,通过序列比对和进化树分析,早期的研究者发现,SARS-CoV-2与蝙蝠SARS-like CoVs序列同源性最高,病毒很可能来源于蝙蝠[2, 3, 5, 8-10],且没有近期重组的痕迹,排除了病毒由人工重组而产生的可能[3, 9]。

    有研究者结合相对同义密码子使用度偏好性分析猜测病毒可能来源于蛇[11],但该结果受到其他人的质疑;也有研究结果猜测水貂[12]或者穿山甲[13]是SARS-CoV-2的中间宿主。目前,SARS-CoV-2的来源和宿主仍然没有定论,有待进一步的研究。

    在这个过程中,我们最基本的工具是ClustalW,而OmicShare平台上提供的BLAST比对和MUSCLE多序列比对两个小工具,简单易用,不失为一种更优选择。

    图2 SARS-CoV-2与其他冠状病毒的系统发育树分析[4]

    3. 致病机制

    通过与其它冠状病毒进行序列比对,研究者首先对SARS-CoV-2基因组进行注释,发现它的主要组成与SARS-CoV和bat SL-CoVs的相同,如图3所示。对其编码的蛋白进行氨基酸同源性比对发现,其中非结构蛋白(nsp)、被膜蛋白(E)、膜蛋白(M)的氨基酸同源性较高,而棘突蛋白(Spike)S1的变异性较大。[2-4, 14, 15]

    冠状病毒Spike蛋白是与宿主细胞结合的关键结构域,其中的S1亚基含受体结合域(RBD),通过氨基酸序列比对[15]和蛋白质三级结构预测[4]发现,SARS-CoV-2的RBD与SARS-CoV极为相似(见图4),猜测SARS-CoV的受体ACE2也能与SARS-CoV-2结合,介导SARS-CoV-2入侵宿主细胞。

    而接下来发表在《nature microbiology》[16]和《Science》[17]的两篇文章则通过相关的受体-配体结合实验验证了这一猜想,证实ACE2就是SARS-CoV-2在宿主细胞上的受体。

    图3 SARS-CoV-2及其他冠状病毒的基因组结构预测[14]

    图4 SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV RBD三级结构预测[4]

    之后,研究者将探询的目光投向了人体内ACE2的表达情况,希望通过找到ACE2高表达的器官、组织、甚至是细胞,为新冠肺炎的预防和治疗提供指导,单细胞转录组测序(scRNA-seq)的出现完美地解决了这这一问题。

    多个研究者利用已有的单细胞转录组数据,首先对目标组织进行细胞聚类鉴定,再检测ACE2在各类细胞中的表达丰度。结果表明,ACE2在大量细胞中都存在高表达,如肺AT2细胞[8, 18]、食管上皮细胞[8, 18]和回肠、结肠吸收性肠上皮细胞[8, 18, 19]、肾脏细胞[8, 20, 21]、精巢各细胞[20, 22-24]。

    这一结果也许能解释一部分SARS-CoV-2感染途径多样化的原因,另一方面也提醒在治疗患者时不仅需要关注肺部损伤,还需要注意其他组织器官的损伤,这样才能起到更好的治疗效果。

    图5 ACE2在结肠上皮细胞中特异性表达[19]

    从现有的文献可以看出,SARS-CoV-2组学相关的研究正处于起步阶段,还有大量的谜团等待着我们去解开,未来的研究之路仍然漫长。

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    网址:https://www.omicshare.com/

    目前OmicShare有83种分析工具,能一站式解决各种图表和分析,再也不用在电脑里安装各式各样的生物学软件。注释工具如KEGG功能注释、GO功能注释、AnimalTFDB注释、Pfam注释等等,能帮助完成基因组、转录组、蛋白质组的解析。序列处理工具如Blast比对和Muscle比对,能更快更准确地完成序列比对。还有众多的绘图工具,如t-SNE、热图、气泡图、小提琴图、维恩图工具等。

    这些小工具非常容易上手,只需要线上上传数据,就可以得到所需的分析结果和可视化图形,快来体验吧!



    参考文献:
    [1]GORBALENYA A E. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus–The species and its viruses, a statement of the Coronavirus Study Group [J]. BioRxiv, 2020,
    [2]ZHOU P, YANG X-L, WANG X-G, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin [J]. Nature, 2020, 1-4.
    [3]WU F, ZHAO S, YU B, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China [J]. Nature, 2020, 1-5.
    [4]LU R, ZHAO X, LI J, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding [J]. The Lancet, 2020,
    [5]CHEN L, LIU W, ZHANG Q, et al. RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak [J]. Emerging Microbes & Infections, 2020, 9(1): 313-9.
    [6]MANNING J E, BOHL J A, LAY S, et al. Rapid metagenomic characterization of a case of imported COVID-19 in Cambodia [J]. bioRxiv, 2020, 2020.03.02.968818.
    [7]LANGELIER C, KALANTAR K L, MOAZED F, et al. Integrating host response and unbiased microbe detection for lower respiratory tract infection diagnosis in critically ill adults [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(52): E12353-E62.
    [8]XU D, ZHANG H, GONG H-Y, et al. Identification of a Potential Mechanism of Acute Kidney Injury During the Covid-19 Outbreak: A Study Based on Single-Cell Transcriptome Analysis [J]. 2020,
    [9]PARASKEVIS D, KOSTAKI E G, MAGIORKINIS G, et al. Full-genome evolutionary analysis of the novel corona virus (2019-nCoV) rejects the hypothesis of emergence as a result of a recent recombination event [J]. bioRxiv, 2020, 2020.01.26.920249.
    [10]BENVENUTO D, GIOVANETTI M, SALEMI M, et al. The global spread of 2019-nCoV: a molecular evolutionary analysis [J]. Pathogens and Global Health, 2020, 1-4.
    [11]JI W, WANG W, ZHAO X, et al. Cross-species transmission of the newly identified coronavirus 2019-nCoV [J]. Journal of Medical Virology, 2020, 92(4): 433-40.
    [12]ZHU H, GUO Q, LI M, et al. Host and infectivity prediction of Wuhan 2019 novel coronavirus using deep learning algorithm [J]. bioRxiv, 2020, 2020.01.21.914044.
    [13]LAM T T-Y, SHUM M H-H, ZHU H-C, et al. Identification of 2019-nCoV related coronaviruses in Malayan pangolins in southern China [J]. bioRxiv, 2020, 2020.02.13.945485.
    [14]CERAOLO C, GIORGI F M. Genomic variance of the 2019nCoV coronavirus [J]. Journal of Medical Virology, 2020,
    [15]CHAN J F-W, KOK K-H, ZHU Z, et al. Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan [J]. Emerging Microbes & Infections, 2020, 9(1): 221-36.
    [16]LETKO M, MARZI A, MUNSTER V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses [J]. Nature Microbiology, 2020, 1-8.
    [17]WRAPP D, WANG N, CORBETT K S, et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation [J]. Science, 2020,
    [18]ZHANG H, KANG Z, GONG H, et al. The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection: a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes [J]. BioRxiv, 2020,
    [19]WANG J, ZHAO S, LIU M, et al. ACE2 expression by colonic epithelial cells is associated with viral infection, immunity and energy metabolism [J]. medRxiv, 2020,
    [20]FAN C, LI K, DING Y, et al. ACE2 Expression in Kidney and Testis May Cause Kidney and Testis Damage After 2019-nCoV Infection [J]. medRxiv, 2020,
    [21]HE Q, MOK T N, YUN L, et al. Single Cell RNA Sequencing Analysis of Human Kidney Reveals the Presence of ACE2 Receptor: A Potential Pathway of COVID-19 Infection [J]. Available at SSRN 3544810, 2020,
    [22]SHEN Q, XIAO X, AIERKEN A, et al. The ACE2 Expression in Sertoli cells and Germ cells may cause male reproductive disorder after SARS-CoV-2 Infection [J]. 2020,
    [23]WANG Z, XU X. scRNA-seq Profiling of Human Testes Reveals the Presence of ACE2 Receptor, a Target for SARS-CoV-2 Infection, in Spermatogonia, Leydig and Sertoli Cells [J]. 2020,
    [24]ZHANG J, WU Y, WANG R, et al. Bioinformatic Analysis Reveals That the Reproductive System is Potentially at Risk from SARS-CoV-2 [J]. 2020,


    本文作者:基迪奥-彗星

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