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基迪奥客户文章——“洋兰之王”花色的秘密

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    发表于 2020.3.27 10:23:42 | 显示全部楼层 |阅读模式
    代谢组与表型联系最为紧密,很多时候大家会选择再结合转录组数据进行关联分析,这样就可以从基因的角度,研究疾病或外界环境改变后,生物体相应发生的生物学过程的变化,并深入分析决定表型的分子调控机制。

    这两个组学关联分析有两种较为常规的思路:一种是先在转录组当中找到差异基因,再结合代谢组数据利用O2PLS等模型整合两个组学的数据,快速鉴定与代谢物相关的差异功能基因;另外一种就是直接关注与研究目的最相关的代谢通路,然后分析基因与代谢物之间的调控关系,或者直接挑出和关注的代谢物合成通路相关的基因进行研究。

    下面这篇发表在Nature子刊上的基迪奥客户文章,就属于第二种研究思路。文章利用二代+三代转录组+代谢组技术研究花色图案形成机制,文章思路比较容易复制,图形又好看,对于想做代谢+转录组学研究的人来说,欣赏兰花的同时,可以好好研究一下研究思路呀。


    发表期刊:Communications Biology
    合作单位:中国林业科学研究院

    一、研究背景

    花色图案通常是由花瓣的颜色分化形成的,除了具有重要的观赏性,还可以帮助植物吸引授粉者。而对于大多数的植物来说,萼片是绿色的,对于颜色形成没有什么贡献。但兰花的独特之处在于,萼片和唇瓣像花瓣一样鲜艳。花被和唇瓣内的色素分布不平衡,使兰花显示出各种花色图案。

    虽然许多研究已经报道了花中色素生物合成的机制,但不同类型的色素在萼片和花瓣之间的颜色模式的形成还没有被系统地描述。

    这篇文章就以著名的观赏兰花品种,卡特兰栽培种Rhyncholaeliocattleya Beauty Girl‘KOVA’(KOVA)作为研究对象,揭秘兰科植物花色图案的形成机制。

    二、研究材料

    1. 收集D1,D4,D7,D8的KOVA的萼片(Sepal)、侧瓣(Petal)、上唇瓣(Epichile)紫红区域和下唇瓣(Hypochile)黄色区域,四个个体为一个重复,每个阶段各三个生物学重复,进行二代转录组测序,对D7和D8各部位进行靶向代谢组学定量分析(图1);

    图1  采样策略

    2. 对D1,D7,D8各部位花等量混合进行三代测序。

    三、研究思路


    四、研究结果
    1. KOVA发育过程中的形态学观察

    在进行分子学研究的时候,文章通常都会先从宏观角度观察样本的变化,有的是利用宏观的统计数据说明处理所带来的表观上的影响,而像本文中,主要目的是为了确定采集样本进行组学研究的合适的时间点。

    作者通过形态学研究发现,在D2-D7之间,花被和唇瓣颜色逐渐发生了变化,开花后D7-D8,颜色又进一步发生了变化,花被的颜色逐渐变为淡粉红色;下唇瓣变为黄色;下唇瓣变为紫红色。

    根据观察结果,作者分别在D1,D4,D7,D8收集了萼片、侧瓣、上唇瓣紫和下唇瓣,用于转录组测序和代谢组鉴定。

    2. 用代谢组对色素成分进行鉴定和定量

    花青素和类胡萝卜素都是在花中广泛分布的色素,KOVA的红色和黄色也是分别由这两种色素决定的,所以作者直接选择靶向代谢组学对这两种色素进行了分析。


    研究使用LC-ESI-MS/MS对D7和D8的KOVA定性分析和定量分析,共鉴定到了11种类胡萝卜素和5种花青素。对各部位色素含量进行比较,发现类胡萝卜素在下唇瓣中含量最高,花青素在上唇瓣中含量最高。从D7到D8,花中所有部位的类胡萝卜素、花青素和叶绿素含量均有所下降,而花被中叶绿素的含量在D7时高于上唇瓣和下唇瓣。

    代谢组整体分析结果表明,通过花青素生物合成途径(ABP)合成的花青苷和通过花类胡萝卜素生物合成途径(CBP)合成的叶黄素和α-胡萝卜素,有助于KOVA紫红、黄色的形成,而绿色来源于叶绿素(图2)。

    图2  对D7和D8的KOVA中的色素进行定性和定量分析

    3. 用转录组分析色素生物合成通路中结构基因的表达

    已有文献报道,ABP和CBP中关键的转录因子会通过调节结构基因的表达从而影响花色的形成,所以文章对不同部位的组织进行了三代全长(ISO-seq)和二代转录组(RNA-seq)测序,然后直接结合表型分析了和ABP,CBP相关的isoforms/unigenes的表达情况。

    首先对ABP相关的结构基因进行分析,结果表明:在D1,基因几乎没表达,这与KOVA还没有红色出现的表型一致;在D4,基因上唇瓣中表达升高,而KOVA这时也显现出了明显的紫红色;在D7,基因在花被和上唇瓣中都有表达,但在上唇瓣中的表达水平低于D4;在D8,基因在所有组织中的表达均降低,花被和上唇瓣在表型上也分别呈淡粉红色和浅紫红色(图3)。

    图3  从D1到D8,KOVA表型和ABP与CBP结构基因热图变化情况

    然后对CBP相关的结构基因进行分析,这部分结果稍微复杂一点,也对D1,D4,D7,D8基因表达情况进行了总结,发现不同组织不同基因表达情况会有所不同。
    结果表明开花后,大多数的基因尤其是PSYs和BCH1s持续上调,支持了形态学解剖和代谢组学分析的结果,表明类胡萝卜素含量在下唇瓣中的含量最高而产生黄色。

    4. 参与色素生物合成调控的关键转录因子的鉴定

    已有文献报道,转录因子RCP1(R2R3-MYB)能调节ABP结构基因的表达影响花色的形成,也能激活CBP结构基因并增加类胡萝卜素在某些花中的积累。所以文章重点研究了这些转录因子,和它们所能调控的基因。

    作者首先研究了一下这个转录因子的来源,用最大似然法(ML)构建了进化树,发现来自KOVA的11个R2R3-MYBs来自R2R3-MYBs亚群21,和CBP中一个正向调节因子,RCP1相关。还有两种R2R3-MYBs来自亚群6,和在ABP中一个正向调节因子PeMYB2相关(图4a)。

    接着,作者对这些转录因子的FPKM值进行了热图的分析,看了一下在不同组织、不同时间,它们的表达量类型。然后又进一步利用WGCNA确认了这些转录因子在花发育阶段的潜在功能。

    结果发现,在划分的17个共表达模块当中,midnight-blue模块,属于亚群21类型II 的R2R3-MYB(Unigene0031636)和BCH1s存在共表达的情况;在light-yellow模块中属于亚群6的类型I R2R3-MYB(Unigene0056193)和ABP结构基因存在共表达。

    综合以上进化树,热图和WGCNA结果来看,在花的发展阶段,Unigene0031636和CBP结构基因表达相关,这种Unigene是激活CBP结构基因表达的候选基因,被定为能促进兰花类胡萝卜素沉积的基因(RcPCP1)。Unigene0056193是促进ABP结构基因表达的候选基因,被定为兰花促进花青素色素沉着1(RcPAP1)。Isoform0012108被认为是能激活ABP的候选基因,被定为兰花促进花青素色素沉着2(RcPAP2)。最后作者用qRT-PCR验证了这些基因的表达(图4b)。


    图4 利用生物信息学分析鉴定参与色素生物合成的R2R3-MYB候选物

    之后,通过瞬时过表达技术对挑出来的三个候选基因的功能进行了验证。利用农杆菌将rcrcp1和rcpap1/2导入到蝴蝶兰杂交种的花被中,结果表明,rcrcp1和rcpap1/2分别能激活CBP和ABP结构基因,促进蝴蝶兰杂交花黄色或红色色素沉着。

    5. 确定B-class AP3-和AGLC-like MADS-box基因参与花色形成

    作者再次根据文献得知,植物生殖器官发育过程中发挥重要作用的MADS-box一类转录因子,根据植物ABCDE模型,不同的组合决定了花的器官形成。所以作者从转录组数据当中筛选出了MADS-box B层级的基因AP3-和AGL6-like基因,利用NJ方法构建系统发育树对AP3和AGL6的不同亚组进行了鉴定(图5a),并应用热图在花卉不同发育阶段对MADS-box基因表达谱进行了分析。

    结果表明,基因表达量存在明显的时空特异性,而基因AP3-和AGL6-like基因的不同组合参与到了KOVA发育阶段不同组织的确定:AP3-1/3/4和AGL6-1与萼片发育有关,AP3-1/2/3/4和AGL6-1与花瓣发育有关,AP3-1/2/3/4和AGL6-2与唇瓣发育有关。AP3-1/4s在紫红上唇瓣转录水平高于黄色的下唇瓣,而在下唇瓣中AP3-2s和AGL6-2s的转录水平高于上唇瓣。

    根据WGCNA结果,基因AP3-和AGL6-like基因和ABP结构基因并不存在共表达的情况,但AGL6-2s和BCH1s和RcPCP1共表达,AP3-1/4s和PSYs,ZDSs,Z-ISO在花的发育阶段存在共表达(图5b)。


    图5  花发育过程中花被和唇瓣中AP3和AGL6样基因的时空表达分析

    为了进一步研究基因AP3-和AGL6-like基因在萼片/花瓣之间的差异表达,采用qRT-PCR分析了这些MADS-box基因在D4和D7萼片/花瓣中的表达谱。

    结果表明,颜色相近的萼片/瓣片之间ap3-1/2/4和agl6-2的表达差异小于不同颜色的唇瓣之间的表达差异。AP3-1/2/4s和Agl6-2s在上唇瓣和下唇瓣之间的表达水平的差距大于萼片和花瓣。

    最后作者还分析了一种KOVA突变体(M1),这种突变体的唇瓣变成了花瓣,在D8时的上唇瓣和下唇瓣的颜色分别由原来的黄色和紫红色变为非常浅的黄色和几乎白色。由于在完全开花之前,无法区分它们和正常KOVA之间的差别,所以只收集了D8的M1样品,然后比较基因表达情况的变化。

    结果发现,AP3-1/4和AGL6-2在M1唇瓣中的表达低于野生型,rcpcp1、bch1和rcpap2在M1中明显下调。

    6. 推测KOVA花色形成的分子机制

    综合以上结果,作者推测在KOVA发育的过程中,RcPAP1/2,RcPCP1和AP3/AGL6 MADS-box基因可能共同调节花被和唇瓣的颜色分化,这可能导致和ABP和CBP通路相关的结构基因的时空表达,决定了颜色的分化。

    具体如下:开花前,在上唇瓣中花青苷逐渐积累最终产生紫红色;在开花后,花被中花青苷和类胡萝卜素含量下降使花被变成淡粉色,下唇瓣中极高的α-胡萝卜素和叶黄素含量使下唇瓣变为黄色。

    图6  KOVA发育过程中萼片、花瓣和唇瓣颜色分化的机制

    五、文章小结
    对于这篇文章,我们可以从以下几个方面作为研究的参照:

    样本选择方面,大家经常表示不知道样本的时间点如何选择,然后跟着感觉取了三个时间点。

    这篇文章就更严谨了一些,对表型做了更详细的观察,最后确定下了采样的天数。并且有的文章可能就做了一个组织的测序,这篇文章不仅有兰花本身花色形成的结果,还有个体内不同组织的横向比较,这也是个加分项。

    分析思路方面,重点关注的部分一个是代谢通路,一个是转录因子。

    文章先从代谢组学角度分析了一下和花色最相关两种色素的分布,然后又利用二代加三代的转录数据,结合文献,对已知的与合成这两种色素代谢通路相关的转录因子,还有和花的器官形成有关的一类转录因子,分别做了一番分析,看看在不同部位中,转录因子的表达如何,哪些是核心的基因,都和哪些基因存在共表达。

    分析方法方面,主要用到的是进化树,热图和WGCNA,分别可以用于确定转录组因子的分类、表达量和核心基因以及它们所调控的基因,然后用网络图可视化了这部分结果(通篇图形绘制配色柔和统一,看着真的舒服)。

    实验方面,主要用到了qPCR和瞬时过表达技术,验证了分子的功能,也不是很难的技术。

    综合来看,文章用到的分析手段和实验方法都不难,用比较常规的思路完整的回答了一个生物学问题,现在还不知道杂志的影响因子能达到多少,至少对于想要照搬思路的人来说,很值得参考。

    Tips
         
    除了这篇文献,扫码填写表单可以再拿到另外几篇同类型基迪奥的转录和代谢关联研究的客户文章,大家可以对比思考一下,比如同样是研究兰花花色,另外一篇做的有什么不同。在药用植物当中,是不是也是这样分析的呢?

    本活动最终解释权归基迪奥生物所有


    参考文献
    Li, B., Zheng, B., Wang, J. et al. New insight into the molecular mechanism of colour differentiation among floral segments in orchids. Commun Biol 3, 89 (2020).

    本文作者:基迪奥-萌神




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