查看: 3049|回复: 17

iTRAQ蛋白定量实验流程介绍

  [复制链接]
  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


    发表于 2015.12.30 13:14:29 | 显示全部楼层 |阅读模式
    越来越多的我关注蛋白水平的变化,方法也有不同,但是大体思路是一样的,下面介绍下iTRAQ蛋白定量原理,供大家理解。
    1.蛋白提取步骤
    1)剪取适量样品转移至1.5ml离心管,用剪刀剪成细小碎片;
    2)加入适量裂解液,终浓度为1mM的PMSF、2mM 的 EDTA,5min 后加入终浓度为10mM的DTT;冰浴超声5min,  25000g*4℃离心20min,取上清;
    3)向上清液中加入5 倍体积的冷丙酮溶液、终浓度为 10mM 的DTT,-20℃沉淀过夜;25000g*4℃离心20min,除上清;
    4)向沉淀加入1.5ml冷丙酮、终浓度 10mM的 DTT,-20℃沉淀 30min,25000g*4℃离心20min 除上清;

    5)重复步骤4一次;
    2、蛋白定量---考马斯亮蓝法,如下:

    3、蛋白SDS-PAGE电泳
    分离胶的浓度:12%SDS聚丙烯酰胺凝胶

    原理:SDS为阴离子表面活性剂,打断蛋白氢键和疏水键,与蛋白形成复合物带强负电荷,掩盖蛋白原来的电荷差异。蛋白迁移率不受电荷和分析性状影响,只按照分子大小迁移。
    4、酶解
    每个样品精确取出100μg蛋白。
    按蛋白:酶=20:1的比例加入Trypsin(胰蛋白酶) 37℃酶解4h
    按上述比例再补加Trypsin一次,37℃继续酶解8h




    本帖子中包含更多资源

    您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

    x
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


     楼主| 发表于 2015.12.30 13:16:08 | 显示全部楼层
    5、iTRAQ 标记
    •酶解结束后,将肽段冷冻抽干,再用0.5M的TEAB复溶;
    •将iTRAQ标签试剂取出,用异丙醇活化后,对应地加入到相应的样品中;
    •在室温条件下精置孵育2h。
    •标记完毕后将同个group内的多个样品混合成一管,冷冻抽干。D:\AnZhuanPan\Temp\5\标记
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


     楼主| 发表于 2015.12.30 13:24:08 | 显示全部楼层
    6、液相分离
    采用岛津LC-20AB液相系统(或者其他系统)进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段复溶并进行梯度洗脱。经过筛选得到10个组分。每个组分分别用Strata X除盐柱除盐,然后冷冻抽干。
    7、液相串联质谱分析
    将抽干的每个组分采用试剂除去不溶物质。每个组分通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪或者其他液相质谱仪进行分离。
    经过液相分离的肽段进入到串联ESI质谱仪:经过一级质谱的筛选后。用碰撞能量对肽段进行筛选,二级碎片在Orbi中检测,分辨率为17500。每个峰强度超过20000的一级母离子打15个二级谱图,一级扫描和二级扫描交替进行。最终进行二级扫描鉴定。
    8.下机数据
    下机数据为raw后缀文件,用Proteome Discoverer (ver. 1.3.0.339; ThermoFisher Scientific, San Jose, CA)软件整合并转化成mgf后缀文件,再用Mascot或其他软件进行肽段和蛋白的鉴定和定量。

    好啦,实验部分就这么多啦,接下来就是生物信息分析了啊。。。

    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.3.15 09:02
  • 签到天数: 52 天

    连续签到: 16 天

    [LV.5]常住居民I

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    0
    奥币
    994
    积分
    24
    注册时间
    2015.12.29
    在线时间
    10 小时

    发表于 2016.1.5 11:08:44 | 显示全部楼层
    实验过程好简洁。
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2019.1.16 14:02
  • 签到天数: 159 天

    连续签到: 1 天

    [LV.7]常住居民III

    管理员

    Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

    主题
    23
    奥币
    31
    积分
    412
    注册时间
    2015.12.17
    在线时间
    150 小时

    活跃会员优秀版主


    发表于 2016.1.5 14:23:22 | 显示全部楼层
    楼猪 不错啊,不过真实实验应该更复杂吧。不同类型的样本提取方法可能不一样。
    我外在的一本正经掩饰不住内心的闷骚!
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    3 天前
  • 签到天数: 520 天

    连续签到: 2 天

    [LV.9]以坛为家II

    版主

    Rank: 10Rank: 10Rank: 10

    主题
    63
    奥币
    4537
    积分
    2155
    注册时间
    2016.1.6
    在线时间
    279 小时

    活跃会员


    发表于 2016.1.6 17:06:39 | 显示全部楼层
    看似简单其实最后的数据分析还是比较复杂的,不过数据很不错,比起我们双向来做就好了很多
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.2.19 13:30
  • 签到天数: 19 天

    连续签到: 1 天

    [LV.4]偶尔看看III

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    1
    奥币
    559
    积分
    41
    注册时间
    2015.12.17
    在线时间
    10 小时

    发表于 2016.1.7 18:18:28 | 显示全部楼层
    不懂的过来学习一下
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.1.7 19:53
  • 签到天数: 1 天

    连续签到: 1 天

    [LV.1]初来乍到

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    0
    奥币
    406
    积分
    13
    注册时间
    2016.1.7
    在线时间
    9 小时

    发表于 2016.1.7 20:06:20 | 显示全部楼层
    学习一下~很棒很棒,32个赞!!!
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    3 天前
  • 签到天数: 520 天

    连续签到: 2 天

    [LV.9]以坛为家II

    版主

    Rank: 10Rank: 10Rank: 10

    主题
    63
    奥币
    4537
    积分
    2155
    注册时间
    2016.1.6
    在线时间
    279 小时

    活跃会员


    发表于 2016.1.9 11:50:36 | 显示全部楼层
    喜欢的很
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


     楼主| 发表于 2016.1.10 12:45:22 | 显示全部楼层
    阿福 发表于 2016.1.5 14:23
    楼猪 不错啊,不过真实实验应该更复杂吧。不同类型的样本提取方法可能不一样。 ...

    真实的实验操作肯定比较复杂啦,此处说的是原理和大致步骤,呵呵
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


     楼主| 发表于 2016.1.10 12:46:06 | 显示全部楼层
    496071151 发表于 2016.1.6 17:06
    看似简单其实最后的数据分析还是比较复杂的,不过数据很不错,比起我们双向来做就好了很多 ...

    技术不断更新,蛋白定量技术也会越来越成熟的。。。
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


     楼主| 发表于 2016.1.10 12:46:27 | 显示全部楼层
    xujianbo 发表于 2016.1.7 20:06
    学习一下~很棒很棒,32个赞!!!

    有所帮助就好!
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.9.21 09:09
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    13
    奥币
    1625
    积分
    200
    注册时间
    2015.11.23
    在线时间
    31 小时

    发表于 2016.1.11 14:17:34 | 显示全部楼层
    跑来学习一下 好清晰的整理啊!
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

    该用户从未签到

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    3
    奥币
    415
    积分
    26
    注册时间
    2016.2.24
    在线时间
    10 小时

    发表于 2016.2.26 14:25:41 | 显示全部楼层
    为什么Bradford定量时误差很大?都是10微克蛋白明显结果矛盾的不要不要的?蛋白浓度测得分别是1,2是4微克/微升;3,4是2.5微克/微升;5,6是2.3微克/微升;7,8是2.8微克/微升。看帖子写的是Bradford的范围是0-1微克/微升,是不是超过这个范围就不准了?图上3的所以条带明显比1的都淡,应该是有的淡有的浅啊。

    本帖子中包含更多资源

    您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

    x
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2017.1.9 09:14
  • 签到天数: 38 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    22
    奥币
    1657
    积分
    268
    注册时间
    2015.12.8
    在线时间
    55 小时

    活跃会员优秀版主


     楼主| 发表于 2016.3.2 17:49:29 | 显示全部楼层
    天上空 发表于 2016.2.26 14:25
    为什么Bradford定量时误差很大?都是10微克蛋白明显结果矛盾的不要不要的?蛋白浓度测得分别是1,2是4微克/ ...

    任何技术都有一个量程范围,所以蛋白太高或者太低,误差都会偏大
    图中3上样量比较少,所以其中蛋白的含量可能比1少啊,所以正常的出现你这种结果,
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2016.6.2 09:56
  • 签到天数: 2 天

    连续签到: 1 天

    [LV.1]初来乍到

    钵水母

    Rank: 3Rank: 3

    主题
    0
    奥币
    381
    积分
    73
    注册时间
    2016.5.30
    在线时间
    1 小时

    发表于 2016.5.31 08:34:22 | 显示全部楼层
    楼主专家
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    yes!
    2020.1.7 16:33
  • 签到天数: 61 天

    连续签到: 2 天

    [LV.6]常住居民II

    中华鲟

    Rank: 5Rank: 5

    主题
    2
    奥币
    810
    积分
    867
    注册时间
    2019.10.25
    在线时间
    29 小时

    发表于 2019.12.7 07:56:03 | 显示全部楼层
    太棒了,感谢楼主分享
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    yes!
    2020.1.10 11:08
  • 签到天数: 2 天

    连续签到: 1 天

    [LV.1]初来乍到

    帝王蝶

    Rank: 4

    主题
    0
    奥币
    214
    积分
    293
    注册时间
    2019.11.21
    在线时间
    9 小时

    发表于 2020.2.1 21:41:37 | 显示全部楼层
    学习
    回复

    使用道具 举报

    您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

    本版积分规则

    快速回复 返回顶部 返回列表