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[转录组] RT-PCR引物设计参考基因组版本的问题

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  • TA的每日心情

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    发表于 2017.3.7 11:40:52 | 显示全部楼层 |阅读模式

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    想请问各位老师:本人做的是小麦有参转录组,16年做的,现在挑选基因设计引物,公司把当时测序的参考基因组的序列也都返回来了,但由于参考基因组的版本更新太快了,同样的基因id序列是完全不一样的,根据公司当时测序的基因序列设计引物时,blast一比对,引物特异性非常不好,除了比对到目标序列外,小麦其他染色体上的基因序列也都有比对到,用不同的软件设计,结果都一样。
        这个基因还是验证的关键基因,那么遇到这种情况,该怎么办呢?能不能用最新版本的这个基因的CDS序列设计呢,试了试结果还挺好,是有特异性的,但转念一想,用新版本的序列设计应该是不能用的嘛!该怎么办呢?困扰了好久,还请各位大神给与指导
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  • TA的每日心情
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    发表于 2017.3.8 05:33:05 | 显示全部楼层
    我就是做小麦的,之前就设计过特异引物,不过最好多设计几对,这样成功的几率大许多。还要验证引物的效率哦。
    参考的基因组都是从Esemble 上面下载的CS的A,B,D homolog gene, 对吧?最好把这些基因的cDNA序列下载下来,然后做多重比对,可以选择特异性高的编码区或者3'UTR区。
    另外软件你选的是啥?
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  • TA的每日心情

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     楼主| 发表于 2017.3.12 09:49:46 | 显示全部楼层
    参考的基因组是Ensembl release 30 IWGSC1.0版本的,用基因ID号在参考基因组里找的CDS序列,进行引物设计,设计的软件刚开始用的Primer 5,结果设计出来的在NCBI里比对,好多都是非特异性的,现在就直接用NCBI里的primer blast设计了
        你说的多重比对是一个思路,我试试
        非常感谢你的解答,对于现在的我来说,有人能给与正确指导,很满足,很感谢
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  • TA的每日心情
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    发表于 2017.3.15 12:43:48 | 显示全部楼层
    新版本基因组是可以使用的,没有问题。 method就说明: primers were designed according to XXX (data has not published)。类似情况很多,就是数据没有公布,但在其他研究中已经开始内部使用了。
    新的一天加油!
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