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[转录组测序] 获得微生物重要性状,如何进一步研究?

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  • TA的每日心情

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    发表于 2017.11.1 11:54:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
    我们分离某个微生物,肯定是为了研究其某种重要性状。例如致病能力不同,药物耐受性不同,发酵能力不同等。针对这些性状,如果能了解其背后的分子机理,无论是对疾病治疗,还是对药物开发以及生产应用,都具有非常大的意义。

    针对重要性状的研究,可以通过比较基因组的方法,寻找基因组的重要变异信息。当然,如果要细致深入研究,基因的表达及功能研究是个绕不开的课题,针对这种对基因信息的深入研究,转录组联合代谢组的方法就尤为适合。下面我们举个例子看看转录组与代谢组结合,如何研究微生物的重要性状的分子机制。

    氧气对链球菌生理生长与代谢影响


    研究背景


    中间链球菌(S. intermedius)属于兼性厌氧菌,是米勒链球菌(SMG)组的一种,能够生活在人体上呼吸道及胃肠道等地方,常常引起化脓性感染和生殖道感染等多种疾病。人体的氧自由基甚至氧气的存在会影响其生长,从而影响其致病能力。但中间链球菌突变体在氧胁迫下也能够生长,为更好了解其致病机制,通过转录组与代谢组相结合的方法研究氧气对其生理生长的影响。

    研究思路

    转录组:有氧与无氧条件下培养的中间链球菌各3重复。
    代谢组:有氧与无氧条件下培养的中间链球菌,细胞内代谢物、细胞外代谢物、培养基(空白对照)各5重复。



    研究结果

    1.氧气引起细菌转录组发生改变

    利用转录组测序,一共鉴定了1815个基因,分别属于58条通路。根据基因在含氧与无氧中的变化情况,把所鉴定的通路分为无变化、无氧应激、混合应激及有氧应激四种类型(图1左)差异表达分析发现297个基因有2倍以上的变化,有氧与无氧条件下的基因表达差别较大(图1右)。这些都证明氧气对中间链球菌基因表达产生重要影响。


    图1. 有氧及无氧条件下的转录组分析(左图:两种条件下的基因表达情况分析,红色为无氧条件下下调基因,黄色为无氧条件下上调基因,绿色为没变化基因。因此鉴定的基因分为4类,全绿为“无变化”类;只有红绿为只与有氧条件相关类;只有黄绿为只与无氧条件相关类,红黄绿为混合类。右图显示OPLS-DA(本质是PLS-DA)分析结果,表示无养与有氧条件下,细菌基因表达差别很大。证明氧气对细菌在转录组层面的影响很大)

    2.微生物代谢产物受氧气影响

    研究完氧气对微生物基因表达的大致影响后,进一步通过代谢组分析,研究氧气是否也引起代谢产物的变化。结果发现,在中间链球菌细胞内鉴定了1885个代谢物,其中710个产物在不同氧条件下呈现显著差异。在细胞外则鉴定了3382个代谢物,存在显著变化的有1307个。这些差异代谢物总共分布在28条主要代谢通路当中。代谢组结果证明氧气能够引起中间链球菌胞内(图2左)和胞外(图2右)的代谢产物改变。


    图2. 有氧(橙色)和无氧(蓝色)条件下对细胞内(左)外(右)代谢物影响
    (Anaerobic代表无氧条件,Aerobic代表有氧条件,TH broth代表培养基)


    3.转录组与代谢组发现核心代谢途径受氧气影响

    前面结论已经证明氧气对中间链球菌的生长有影响,作者发现在有氧条件下,细菌生长速度放缓。因此为了解氧气抑制细菌生长的原因,作者结合转录组及代谢物数据,从初级代谢途径层面解答这一问题。

    通过分析发现,氧气主要影响中间链球菌的核心碳代谢、精氨酸脱亚胺酶途径(ADI)和核苷酸(嘌呤、嘧啶)合成三条途径。例如,无氧促进精氨酸脱亚胺酶途径与精氨酸吸收的基因的上调,从而提高ATP的合成,同时,在这条途径中与嘧啶从头合成的基因也被证明在无氧条件下表达更为活跃(图3)。

    到这里,作者为什么研究这几条途径呢?理由很简单,因为细胞生长无非与碳水化合物消化(食物),ATP合成(能量代谢)以及核苷酸合成(DNA复制)等行为相关,而上述三条途径恰恰是中间链球菌的核心初级代谢途径,可以说这些途径与细菌的生长息息相关,非研究不可。


    图3. ADI途径的基因表达和产物都受氧气影响

    4.其他代谢途径也参与氧胁迫反应

    重要的代谢途径研究完之后,最后,作者还研究了其他途径是否也参与氧胁迫反应。例如,作者发现氧化应激相关的基因(通过转录组检测)在氧气存在的环境下表达升高了(图4左图蓝色表示升高),表示细菌在氧气条件下启动应激反应,对抗宿主的攻击。

    同时,由于细菌的细胞膜对外界条件异常敏感,因此也研究了其膜成分的变化。发现在有氧与无氧情况下,磷脂(细胞膜主要成分,通过代谢组检测)的组成差别很大,表示其氧气对细胞膜也有影响(图4左)。


    图4. 氧气引起细菌其他途径的改变

    文章小结

    • 本文通过转录组与代谢组,综合研究氧气对中间链球菌的生长以及致病性的影响。
    • 研究从初级代谢途径入手,发现氧气改变了碳水化合物产生、ATP生产和核苷酸合成等多条途径。
    • 最后,结合转录组与代谢组数据,全面分析了氧气也可能对细菌的氧胁迫应激和细胞膜等产生影响。

    参考文献:
    【1】Fei F, Mendonca M L, McCarry B E, et al. Metabolic and transcriptomic profiling of Streptococcus intermedius during aerobic and anaerobic growth[J]. Metabolomics, 2016, 12(3): 46.




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    发表于 2017.11.6 19:58:11 | 显示全部楼层
    结合转录组与代谢组数据,全面分析
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